Les analyses diagnostiques du tableau ont révélé que sous le visage de la Vierge Marie se trouve un dessin bien élaboré, avec les traces d'une patiente recherche de la beauté idéale ; certains émettent l'hypothèse que le modèle féminin de ce visage pourrait être celui de Jerónima de las Cuevas, le seul amour auquel El Greco attacha son cœur. En tout cas, dans ce visage est évidente la recherche de El Greco d’une harmonie parfaite, qui devait montrer comment la personne de Marie de Nazareth est l'effet de l'œuvre de salut réalisée par Dieu, le premier miracle du Christ, l'exemple concret de la façon dont l'être humain devient un chef-d'œuvre d'une profonde beauté spirituelle s'il unit pleinement sa vie à celle du Fils de Dieu incarné.
La figure masculine à côté de Marie est Saint Joseph, correctement représenté sans traces de vieillissement excessif - comme cela se vérifie souvent dans l'art chrétien en raison de l'influence de la littérature apocryphe -. Joseph caresse le petit pied de l'Enfant Jésus, un geste qui exprime la tendresse mais souligne aussi l'expérience de l'Incarnation : le fils engendré par son épouse vierge, qu'il savait n'avoir pas contribué à engendrer, n'est pas l'apparition superficielle d'un être céleste, mais un véritable être humain, doté d'une chair sensible comme la nôtre, mystérieusement formé dans le sein de cette femme par l'intervention miraculeuse du Saint-Esprit. Joseph semble regarder sa femme avec une admiration délicate, comme un bon mari amoureux qui a de l'estime pour sa femme et comme un homme de foi profonde qui loue Dieu dans son cœur pour le prodigieux miracle qu'il a accompli dans leur mariage et dans leurs personnes.
À côté de Marie, il y a aussi une figure féminine, qui s'identifie à Sainte Anne, mère de la Vierge Marie, grand-mère de Jésus. Elle caresse la tête du Christ, dans un climat semblable au précèdent, où s’entremêlent affection et observation émerveillée ; Le regard d'Anna exprime également de la stupéfaction face à ce qu'elle voit que Dieu a fait, presque un sentiment de privilège en pensant à ce qui s'est passé dans sa famille. Le personnage Joachim, son mari, le père de Marie, n'est pas représenté aux côtés d'Anne : souvent, l'iconographie chrétienne ne présente qu'Anne avec la Sainte Famille de l'enfant Jésus, comme pour conserver le souvenir que la naissance du Sauveur avait réjoui le veuvage de la grand-mère. Un autre protagoniste du tableau est le ciel : le fond de l'œuvre est dépourvu de toute référence environnementale, paysagère ou urbaine, il apparaît presque comme un commentaire théâtral et scénographique des personnages, accompagné de nuages au profil irréel, suggérant ainsi un contexte plus interne et symbolique. Au centre de l'attention, El Greco place un acte riche de sens : l'allaitement de Jésus au sein de Marie.
Ce geste peut certainement avoir une connotation éducative sur l'importance d'allaiter directement ses enfants, en évitant la pratique d'utiliser un lait autre que le lait maternel ou les seins d'autres nourrices. Mais le message principal de ce sein offert au Christ est théologique. La représentation de la Vierge allaitant le Christ nouveau-né est particulièrement affectueuse, mais souligne deux faits importants pour la foi. Tout d'abord, il faut souligner la manière déconcertante et émouvante avec laquelle le Sauveur du monde est venu à notre rencontre : l'auteur de la vie, égal au Père en nature divine, en majesté et en toute-puissance, se dépouille de toute grandeur et devient petit au point d’avoir besoin de recevoir, d'être aimé, d'être chéri et accueilli. Le salut par lequel le Fils de Dieu relève l'homme de ses misères et redonne l'espoir à notre existence n'est pas un acte de souveraineté ou une réparation magique de nos personnes, mais l'introduction dans un immense amour qui nous est donné et qui nous demande en réponse notre amour. Ainsi, l'homme redécouvre que Dieu est sa joie, mais il est aussi surpris de découvrir que Dieu est si bon qu'il nous considère comme sa joie et tient en haute estime le peu que nous sommes capables de lui donner.
De plus, la figure de l'Enfant est partiellement recouverte par le tissu jaune avec lequel Marie l'enveloppe, mais les organes génitaux du petit enfant restent exposés et visibles, comme une affirmation supplémentaire du caractère concret de l'humanité qu'il est venu partager avec nous, en tout comme la nôtre, à l’exception du péché. Justement parce que cette humanité est comme la nôtre, elle est vulnérable et déjà destinée à vivre la plus grande épreuve de notre existence, la mort. Les caresses de Joseph sur le pied de Jésus et celles d'Anne sur la tête du Christ semblent presque anticiper les gestes similaires que l'art chrétien représente dans la scène de la Déposition du Christ de la Croix, lorsqu'un autre Joseph, celui d'Arimathie, et d'autres les femmes, compagnes de foi de Marie, pleureront et caresseront les membres torturés et exsangues du Fils de Dieu mort sur la croix, transpercé par les clous et la couronne d'épines. Par ailleurs, Marie est mise en évidence comme celle qui a transmis la vie humaine au Fils de Dieu. Tout comme la foi de l'Église l'a clairement exprimé au Concile d'Éphèse en l'an 431, il est correct d'invoquer Marie comme Mère de Dieu, et pas simplement comme mère de Jésus, puisqu'une mère n'est pas la créatrice de la personne de ses enfants, mais celle qui les reçoit comme un don de Dieu et qui leur transmet le don de la vie humaine. Puisque Jésus est un de la Trinité, c'est-à-dire la Personne divine du Fils, qui s'incarne à travers Marie, elle est effectivement Mère de Dieu, ayant engendré dans son corps le Christ, qui est à la fois vrai homme et vrai Dieu. .
Les vêtements de Marie doivent également être interprétés théologiquement dans ce sens, qui selon la logique “grecque” du peintre, expert en icônes byzantines, se caractérisent par les couleurs classiques, rouge et bleu avec un voile blanc. Le rouge, dans une teinte sombre, est typique du costume impérial de l'empereur romain et byzantin, c'est donc un signe de la très haute dignité dont a été revêtue l'humble fille de Nazareth. Le bleu est la couleur identique du manteau qui recouvre le Christ dans les icônes orientales, il signifie donc la similitude avec le Christ qui a été parfaitement réalisée en Marie. Le voile blanc, en plus d'être un signe de pureté sans tache de péché, est aussi un souvenir physique de la relique du voile de la Vierge Marie, arrivée d'Orient par les mains de Charlemagne et conservée dans la splendide cathédrale française de Chartres.
